SPEKTROFOTOMETRI

SPEKTROFOTOMETRI

Spektrofotometri merupakan suatu metode analisa yang didasarkan pada pengukuran beberapa sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube.

Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri.

Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombangdan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda.

Absorbsi sinar oleh larutan mengikuti hukum Lambert-Beer, yaitu :

A =     log ( Io / It )         =  a b c

Keterangan  : Io = Intensitas sinar datang

It = Intensitas sinar yang diteruskan

a = Absorptivitas

b = Panjang sel/kuvet

c = konsentrasi (g/l)

A = Absorban

Spektrofotometri merupakan bagian dari fotometri dan dapat dibedakan dari filter fotometri sebagai berikut :

1. Daerah jangkauan spektrum

Filter fotometr hanya dapat digunakan untuk mengukur serapan sinar tampak (400-750 nm). Sedangkan spektrofotometer dapat mengukur serapan di daerah tampak, UV (200-380 nm) maupun IR (> 750 nm).

2. Sumber sinar

Sesuai dengan daerah jangkauan spektrumnya maka spektrofotometer menggunakan sumber sinar yang berbeda pada masing-masing daerah (sinar tampak, UV, IR). Sedangkan sumber sinar filter fotometer hanya untuk daerah tampak.

3. Monokromator

Filter fotometere menggunakan filter sebagai monokrmator. Tetapi pada spektro digunakan kisi atau prisma yang daya resolusinya lebih baik.

4. Detektor

-   Filter fotometer menggunakan detektor fotosel

-   Spektrofotometer menggunakan tabung penggandaan foton atau fototube.

Komponen utama dari spektrofotometer yaitu :

1.      Sumber cahaya

a.       Untuk radisi kontinue :

·         Untuk daerah UV dan daerah tampak,

·         Lampu wolfram (lampu pijar) menghasilkan spektrum kontiniu pada gelombang 320-2500 nm.

·          Lampu hidrogen atau deutrium (160-375 nm)

·         Lampu gas xenon (250-600 nm)

b.      Untuk daerah IR

Ada beberapa macam sumber sinar yang dapat digunakan yaitu :

1.      Lampu Nerst,dibuat dari campuran zirkonium oxida (38%) Itrium oxida  (38%) dan erbiumoxida (3%)

2.       Lampu globar dibuat dari silisium Carbida (SiC).

3.      Lampu Nkrom terdiri dari pita nikel krom dengan panjang gelombang 0,4 – 20 nm

Spektrum radiasi garis UV atau tampak :

1.      Lampu uap (lampu Natrium, Lampu Raksa)

2.      Lampu katoda cekung/lampu katoda berongga

3.      Lampu pembawa muatan dan elektroda (elektrodeless dhischarge lamp)

4.      Laser

2.      Pengatur Intensitas

Pengatur intensitas berfungsi untuk mengatur intensitas sinar yang dihasilkan oleh sumber cahaya agar sinar yang masuk tetap konstan.

3.      Monokromator

Berfungsi untuk merubah sinar polikromatis menjadi sinar monokromatis sesuai yang dibutuhkan oleh pengukuran.

Macam-macam monokromator :

Ø  Prisma

Ø  kaca untuk daerah sinar tampak

Ø  kuarsa untuk daerah UV

Ø  Rock salt (kristal garam) untuk daerah IR

Ø  Kisi difraksi

Keuntungan menggunakan kisi :

-   Dispersi sinar merata

-   Dispersi lebih baik dengan ukuran pendispersi yang sama

-   Dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spektrum

4.      Kuvet

Pada pengukuran di daerah sinar tampak digunakan kuvet kaca dan daerah UV digunakan kuvet kuarsa serta kristal garam untuk daerah IR.

5.      Detektor

Berfungsi  untuk merubah sinar menjadi energi listrik yang sebanding dengan besaran yang dapat diukur.

Syarat-syarat ideal sebuah detektor yaitu :

a.       Kepekan yang tinggi

b.      Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinnggi

c.       Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.

d.      Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.

e.       Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.

Macam-macam detektor :

a.       Detektor foto (Photo detector)

b.      Photocell

c.       Phototube

d.      Hantaran foto

e.        Dioda foto

f.        Detektor panas

6.      Penguat (amplifier)

Berfungsi untuk memperbesar arus yang dihasilkan oleh detektor agar dapat dibaca oleh indikator.

7.        Indikator

Indikator dapat berupa recorder dan komputer

Ø  Macam Spektrofotometri dan Perbedaannya (Vis, UV, dan IR)

Spektrofotometri terdiri dari beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang digunakan. Diantaranya adalah sebagai berikut:
1. Spektrofotometri Vis (Visible)
2. Spektrofotometri UV (Ultra Violet)
3. Spektrofotometri UV-Vis
4. Spektrofotometri IR (Infra Red)

1.      Spektrofotometri Visible (Spektro Vis)

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible).

Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.

Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilii warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil. Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein). Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna.

Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin. Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam sample.

2.      Spektrofotometri UV (ultraviolet)

Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium.

Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang berarti ‘dua’, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.

Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.

Sebagai contoh pada analisa protein terlarut (soluble protein). Jika menggunakan spektrofotometri visible, sample terlebih dulu dibuat berwarna dengan reagent Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample dapat langsung dianalisa.

Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap sample (Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein terlarut semakin besar.

Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi sample. Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.

3.                  Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.

Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna.

4.        Spektrofotometri IR (Infra Red)

Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri ini berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi infra merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 μm.

Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu gugus fungsi spesifik.

Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas IR terhadap panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan dibandingkan dengan signal standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk metode ini harus dalam bentuk murni. Karena bila tidak, gangguan dari gugus fungsi kontaminan akan mengganggu signal kurva yang diperoleh.

Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared Spectropgotometry (NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan dan pangan guna analisa bahan baku yang bersifat rutin dan cepat.

Ø  Perbedaan Spektrometri dan Spektrofotometri

Dalam bidang kimia analisis, ada beberapa istilah lain yang dekat dengan dunia spektrometri. Misalnya spektroskopi, spektrofotometri, kolorimetri, fotometri, spektrometer, dan lainnya.

a.       Spektroskopi.

Spektroskopi merupakan ilmu yang mempelajari interaksi antara radiasi dan benda sebagai fungsi panjang gelombang.Awalnya spektroskopi hanya mengacu pada pen-dispersi-an cahaya tampak berdasarkan panjang gelombang (misalnya oleh prisma). Untuk selanjutnya konsep ini berkembang untuk menunjuk pada segala bentuk pengukuran kuantitatif sebagai fungsi dari panjang gelombang dan frekuensi, tidak hanya meliputi cahaya tampak. Sehingga istilah ini bisa juga mengacu pada interaksi radiasi partikel atau respon terhadap berbagai range frekuensi. Jadi spektroskopi adalah istilah/nama yang digunakan untuk ilmu (secara teori) yang mempelajari tentang hubungan antara radiasi/energi/sinar (yang memiliki fungsi panjang gelombang, yang biasa di sebut frekuensi) dengan benda. Gabungan respon frekuensi ini disebut sebagai spektrum.

Beberapa macam metode analisa berdasarkan spektroskopi yang ada saat ini adalah:

• Electromagnetic spectroscopy
• Electromagnetic spectroscopy
• Mass spectrometry
• Acoustic spectroscopy
• Dielectric spectroscopy
• Mechanical spectroscopy

b.        Spektrometri.

Spektrometri adalah tehnik yang digunakan untuk mengukur jumlah (konsentrasi) suatu zat berdasarkan spektroskopi. Instrument yang digunakan disebut spektrometer. Jadi ada tiga istilah yang berbeda. Spektroskopi, spektrometri, dan spektrometer. Spektroskopi mengacu pada bidang keilmuan, spektrometri adalah tehnik aplikasi berdasarkan spektroskopi, sedangkan spektrometer adalah alat/instrument yang digunakan dalam tehnik spektrometri.

spektrofotometri juga merupakan tehnik pengukuran jumlah zat yang juga berdasar spektroskopi. Hanya saja pada spektrofotometri, lebih spesifik untuk panjang gelombang UV(Ultraviolet)-dekat, visible, dan infra merah.

Spektrofotometri dimasukkan ke dalam electromagnetik spectroscopy. Alat yang digunakan dalam spektrofotometri disebut spektrofotometer. Alat ini termasuk ke dalam jenis fotometer, suatu alat untuk mengukur intensitas cahaya. Spektrofotometer dapat mengukur intensitas sebagai fungsi dari warna, atau secara lebih khusus, fungsi panjang gelombang.

Sekarang sudah lebih jelas perbedaan antara spektrometri dan spektrofotometri. Itulah sebabnya untuk spektro UV/Vis disebut spektrofotometer UV-Vis, tidak Spektrometer Uv-Vis. Sebetulnya tidak salah juga menggunakan istilah spektrometer untuk Uv-Vis. Namun kurang tepat. kata spektrometer mengandung makna lebih luas ketimbang spektrofotometer.

Kemudian ada lagi yaitu kolorimetri. Kolorimetri adalah tehnik kuantifikasi berdasarkan perbedaan warna. Mirip dengan spektrofotometri, tapi spektra dipersempit hanya pada tristimulus values, dari mana persepsi warna terbentuk. Secara sederhana dapat diasumsikan bahwa kolorimetri adalah pengukuran konsentrasi berdasar perbedaan warna yang tampak oleh mata.

Ø  Spektrofotometri Pada Prinsip Percobaan

Salah satu analisis untuk menentukan kadar suatu senyawa pada suatu sampel adalah dengan cara spektrofotometri. Spektrofotometri merupakan metode analisis yang didasarkan pada besarnya nilai absorbsi suatu zat terhadap radiasi sinar elektromagnetik.

 Prinsip kerja spektrofotometri adalah dengan menggunakan spektrofotometer yang pada umumnya terdiri dari unsur-unsur seperti sumber cahaya, monokromator, sel, fotosel, dan detektor. Sumber radiasi spektrofotometer dapat digunakan lampu deuterium untuk radiasi di daerah sinar ultraviolet sampai 350 nm, atau lampu filamen untuk sinar tampak sampai inframerah. Sinar yang dikeluarkan sumber radiasi merupakan sinar polikromatis, sehingga harus dibuat menjadi sinar monokromatis oleh monokromator. Radiasi yang melewati monokromator diteruskan ke zat yang akan diukur dan sebagian radiasinya akan diserap oleh zat tersebut.

Zat yang  akan  diukur nilai  absorbannya diletakkan pada sel dengan wadah kuvet. Sinar yang diteruskan akan mencapai fotosel dan energi sinar diubah menjadi energi listrik (Khopkar 2003). Namun, nilai yang dihasilkan dari spektrofotometer bukanlah nilai absorban (A) melainkan  transmitan  (T). Oleh karena itu nilai  T  tersebut harus dikonversi ke dalam nilai A zatyang diukur. Konversi menggunakan rumus A= – log % T. Konversi ini dilakukan karena yang terukur adalah nilai transmitan (besarnya sinar radiasi yang melewati zat dan ditangkap detektor), sedangkan yang diinginkan adalah nilai absorban (besarnya sinar radiasi yang terserap oleh zat) dari zat yang diukur.

Penentuan nilai absorban pada percobaan kali ini adalah untuk mengetahui kadar asam amino pada sampel kentang. Penambahan ninhirin dan piridin sebagai pereaksinya, yang selanjutnya dilakukan pemanasan. Menurut Winarno (1997), asam amino merupakan unit pembangun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida pada setiap ujungnya. Pemanasan asam amino dengan ninhidrin akan memberikan kompleks berwarna ungu. Intensitas warna tersebut sebanding dengan konsentrasi asam amino bebas dalam pengukuran absorban pada panjang gelombang yang paling tepat. Asam amino lisin mempunyai rantai cabang yang dapat bermuatan positif maupun negatif, tergantung lingkungannya. Asam amino lisin juga mempunyai rantai cabang gugus basa.

Day dan Underwood (1986) menyatakan bahwa untuk mendeteksi asam amino dalam suatu larutan, maka sebelum larutan tersebut ditetesi piridin dan ninhidrin serta dipanaskan terlebih dahulu. Piridin berguna untuk menganalisis kadar H₂O dalam suatu zat dan menggeser reaksi kearah kanan. Ninhidrin adalah suatu reagen untuk mendeteksi asam amino dan menetapkan konsentrasinya dalam larutan. Senyawa ini adalah hidrat dari triketon siklik dan apabila bereaksi dengan asam amino akan menghasilkan zat berwarna ungu. Panjang gelombang yang paling tepat untuk warna larutan tersebut adalah 625 nm.

     Spektrofotometri visible disebut juga spektrofotometri sinar tampak. Yang dimaksud sinar tampak adalah sinar yang dapat dilihat oleh mata manusia. Cahaya yang dapat dilihat oleh mata manusia adalah cahaya dengan panjang gelombang 400-800 nm dan memiliki energi sebesar 299–149 kJ/mol.

          Elektron pada keadaan normal atau berada pada kulit atom dengan energi terendah disebut keadaan dasar(ground-state). Energi yang dimiliki sinar tampak mampu membuat elektron tereksitasi dari keadaan dasar menuju kulit atom yang memiliki energi lebih tinggi atau menuju keadaan tereksitasi.

           Cahaya yang diserap oleh suatu zat berbeda dengan cahaya yang ditangkap oleh mata manusia. Cahaya yang tampak atau cahaya yang dilihat dalam kehidupan sehari-hari disebut warna komplementer. Misalnya suatu zat akan berwarna orange bila menyerap warna biru dari spektrum sinar tampak dan suatu zat akan berwarna hitam bila menyerap semua warna yang terdapat pada spektrum sinar tampak. Untuk lebih jelasnya perhatikan tabel berikut.

Panjang gelombang (nm)	Warna warna yang diserap	Warna komplementer (warna yang terlihat)
400 – 435	Ungu	Hijau kekuningan
435 – 480	Biru	Kuning
480 – 490	Biru kehijauan	Jingga
490 – 500	Hijau kebiruan	Merah
500 – 560	Hijau	Ungu kemerahan
560 – 580	Hijau kekuningan	Ungu
580 – 595	Kuning	Biru
595 – 610	Jingga	Biru kehijauan
610 – 800	Merah	Hijau kebiruan

         Pada spektrofotometer sinar tampak, sumber cahaya biasanya menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram. Wolfram merupakan salah satu unsur kimia, dalam tabel periodik unsur wolfram termasuk golongan unsur transisi tepatnya golongan VIB atau golongan 6 dengan simbol W dan nomor atom 74. Wolfram digunakan sebagai lampu pada spektrofotometri tidak terlepas dari sifatnya yang memiliki titik didih yang sangat tinggi yakni 5930 °C.

Gambar: jenis spektronic-20 yang bekerja pada rentang panjang gelombang sinar tanpak. Gambar atas merupakan spectronic-20 lama yang sudah jarang bahkan mungkin tidak diproduksi lagi. Sedangkan gambar kedua adalah spectronic-20 terbaru.

        Panjang gelombang yang digunakan untuk melakukan analisis adalah panjang gelombang dimana suatu zat memberikan penyerapan paling tinggi yang disebut λ_maks. Hal ini disebabkan jika pengukuran dilakukan pada panjang gelombang yang sama, maka data yang diperoleh makin akurat atau kesalahan yang muncul makin kecil.

        Berdasarkan hukum Beer absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasi, karena b atau l harganya 1 cm dapat diabaikan dan ε merupakan suatu tetapan. Artinya konsentrasi makin tinggi maka absorbansi yang dihasilkan makin tinggi, begitupun sebaliknya konsentrasi makin rendah absorbansi yang dihasilkan makin rendah. (Hukum Lamber-Beer dan syarat peralatan yang digunakan agar terpenuhi hukum Lambert-Beer Baca.

Hubungan antara absorbansi terhadap konsentrasi akan linear (A≈C) apabila nilai absorbansi larutan antara 0,2-0,8 (0,2 ≤ A ≥ 0,8) atau sering disebut sebagai daerah berlaku hukum Lambert-Beer. Jika absorbansi yang diperoleh lebih besar maka hubungan absorbansi tidak linear lagi. Kurva kalibarasi hubungan antara absorbansi versus konsentrasi dapat dilihat pada Gambar.

Gambar:  Kurva hubungan absorbansi vs konsentrasi

Faktor-faktor yang menyebabkan absorbansi vs konsentrasi tidak linear:

1. Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis termasuk zat pembentuk warna.
2. Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa, namun kuvet dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik.
3. Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat rendah atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan (melalui pengenceran atau pemekatan).

Zat yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri sinar tampak adalah zat dalam bentuk larutan dan zat tersebut harus tampak berwarna, sehingga analisis yang didasarkan pada pembentukan larutan berwarna disebut juga metode kolorimetri.

        Jika tidak berwarna maka larutan tersebut harus dijadikan berwarna dengan cara memberi reagen tertentu yang spesifik. Dikatakan spesifik karena hanya bereaksi dengan spesi yang akan dianalisis. Reagen ini disebut reagen pembentuk warna (chromogenik reagent).

Berikut adalah sifat-sifat yang harus dimiliki oleh reagen pembentuk warna:

1. Kestabilan dalam larutan. Pereaksi-pereaksi yang berubah sifatnya dalam waktu beberapa jam, dapat menyebabkan timbulnya semacam cendawan bila disimpan. Oleh sebab itu harus dibuat baru dan kurva kalibarasi yang baru harus dibuat saat setiap kali analisis.
2. Pembentukan warna yang dianalisis harus cepat.
3. Reaksi dengan komponen yang dianalisa harus berlangsung secara stoikiometrik.
4. Pereaksi tidak boleh menyerap cahaya dalam spektrum dimana dilakukan pengukuran.
5. Pereaksi harus selektif dan spesifik (khas) untuk komponen yang dianalisa, sehingga warna yang terjadi benar-benar merupakan ukuran bagi komponen tersebut saja.
6. Tidak boleh ada gangguan-gangguan dari komponen-komponen lain dalam larutan yang dapat mengubah zat pereaksi atau komponen komponen yang dianalisa menjadi suatu bentuk atau kompleks yang tidak berwarna, sehingga pembentukan warna yang dikehandaki tidak sempurna.
7. Pereaksi yang dipakai harus dapat menimbulkan hasil reaksi berwarna yang dikehendaki dengan komponen yang dianalisa, dalam pelarut yang dipakai.

Setelah ditambahkan reagen atau zat pembentuk warna maka larutan tersebut harus memiliki lima sifat di bawah ini:

1. Kestabilan warna yang cukup lama guna memungkinkan pengukuran absorbansi dengan teliti. Ketidakstabilan, yang mengakibatkan menyusutnya warna larutan (fading), disebabkan oleh oksidasi oleh udara, penguraian secara fotokimia, pengaruh keasaman, suhu dan jenis pelarut. Namun kadang-kadang dengan mengubah kondisi larutan dapat diperoleh kestabilan yang lebih baik.
2. Warna larutan yang akan diukur harus mempunyai intensitas yang cukup tinggi (warna harus cukup tua) yang berarti bahwa absortivitas molarnya (ε) besar. Hal ini dapat dikontrol dengan mengubah pelarutnya. Dalam hal ini dengan memilih pereaksi yang memiliki kepekaan yang cukup tinggi.
3. Warna larutan yang diukur sebaiknya bebas daripada pengaruh variasi-variasi kecil kecil dalam nilai pH, suhu maupun kondisis-kondisi yang lain.
4. Hasil reaksi yang berwarna ini harus larut dalam pelarut yang dipakai.
5. Sistem yang berwarna ini harus memenuhi Hukum Lambert-Beer. 

Menentukan konsentrasi sampel dengan cara kurva kalibrasi

           Konsentrasi sampel dalam suatu larutan dapat ditentukan dengan rumus yang diturunkan dari hukum lambert beer (A= a . b . c atau A = ε . b . c). Namun ada cara lain yang dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi suatu spesi yang ada dalam suatu larutan yakni dengan cara kurva kalibarasi. Cara ini sebenarnya masih tetap bertumpu pada hukum Lambert-Beer yakni absorbansi berbanding lurus dengan konsentrasi.

Langkah-langkah yang perlu dilakukan dalam penentuan konsentrasi zat dengan kurva kalibarasi:

1. Maching kuvet : mencari dua buah kuvet yang memiliki absorbansi atau transmitansi sama atau hampir sama. Dua buah kuvet inilah yang akan digunakan untuk analisis, satu untuk blanko, satu untuk sampel. Dalam melakukan analisis Maching kuvet harus dilakukan agar kesalahannya makin kecil.
2. Membuat larutan standar pada berbagai konsentrasi. Larutan standar yaitu larutan yang konsentrasinya telah diketahui secara pasti. Konsentrasi larutan standar dibuat dari yang lebih kecil sampai lebih besar dari konsentrasi analit yang diperkirakan.
3. Ambilah salah satu larutan standar, kemudian ukur pada berbagai panjang gelombang. Hal ini dilakukan untuk mengetahui pada panjang gelombang berapa, absorbansi yang dihasilkan paling besar. Panjang gelombang yang menghasilkan absorbansi paling besar atau paling tinggi disebut panjang gelombang maksimum (l_maks).
4. Ukurlah absorbansi semua larutan standar yang telah dibuat pada panjang gelombang maksimum.
5. Catat absorbansi yang dihasilkan dari semua larutan standar, kemudian alurkan pada grafik absorbansi vs konsentrasi sehingga diperoleh suatu kurva yang disebut kurvakalibarasi. Dari hukum Lambart-Beer jika absorbansi yang dihasilkan berkisar antara 0,2-0,8 maka grafik akan berbentuk garis lurus, namun hal ini tidak dapat dipastikan.

Misalkan absorbansi yang dihasilkan dari larutan standar yang telah dibuat adalah

Absorbansi	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9
konsentrasi	2 ppm	4 ppm	6 ppm	8 ppm	10 ppm	12 ppm	14 ppm	16 ppm

Grafiknya adalah

6. Ukurlah absorbansi larutan yang belum diketahui konsentrasinya. Setelah diperoleh absorbansinya, masukan nilai tersebut pada grafik yang diperoleh pada langkah 5. Misalkan absorbansi yang diperoleh 0,6. Maka jika ditarik garis lurus konsentrasi sampel akan sama dengan konsentrasi larutan standar 10 ppm. Maka grafiknya sebagai berikut:

Selain dengan cara diatas konsentrasi sampel dapat dihitung dengan persamaan regresi linear:

y = bx + a

persamaan di atas dapat dihitung dengan bantuan kalkulator. Setelah diperoleh persamaan di atas, absorbansi sampel yang diperoleh dimasukan sebagai nila y sehingga diperoleh nila x. Nilai x yang diperoleh merupakan konsentrasi sampel yang dianalisis.